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各位大虾好!这是细菌16S PCR产物电泳图像大小为15kb但条带上下出现弥散现象测序波峰出现重峰现象

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发表于 2019-9-22 18:20:17 |显示全部楼层
  细菌16S rRNA基因序列是集高度保守和变异性与一身的,现在采用的多数PCR扩增引物都是采用的所有细菌的通用引物,即:几乎能够扩增出所有的线S rDNA的扩增面临的主要问题是污染,只要有其他细菌DNA的污染,就可能出现假阳性或测序重叠峰,也就是说一条1500bp的带可能是多个细菌的16s rDNA的扩增产物的混合物。
  1.所有的物品和试剂都要严格防污染,包括taq酶,有很多公司产的聚合酶是用细菌生产的,如果处理纯化不当可能含有细菌的DNA;
  3.由于该基因在多数细菌基因组内是多拷贝的,所以模板DNA的量不宜太多,否则有非特异性扩增(你的带看上去模板DNA就有些过量)
  6.照片中引物二聚体也很多,需适当减少反应体系中引物的用量。追问yanzhiyong2001,你好!按照你的建议,我将模板量和引物量减少了,但条带上面还是有云雾状条带。而且可以确定DNA模板不存在污染现象,请帮忙分析下那些云雾状条带是什么,该怎么解决?
  我的解释:延伸时间过长(我延伸设定的时间是1分45秒)追答我看了你的带,引物二聚体已经没有了。你的阴性对照结果如何?
  带的问题不是太大,因为你的marker也有涂布现象,所以问题可能不完全是PCR的,你先跑个电泳,把上样量减少,估计中间的2个泳道就会十分sharp,最右边的你上样0.5-1微升看看。
  再就是还可以在提高一下复性温度,延伸时间1500bp的可用1-1.5min。本回答由网友推荐已赞过已踩过你对这个回答的评价是?评论收起
  2、测序出现非特异:说明你的原始菌体不单一,建议做个克隆后挑几个斑测序。已赞过已踩过你对这个回答的评价是?评论收起
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